PEWARNAAN GRAM

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI 1


                                                            BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.   LATAR BELAKANG

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.

Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarn    aan dengan fungsi yang berbeda yaitu :

·         Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri)

·         Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri

·         Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada dinding bakteri)

·         Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna primernya.

Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah melengkung dan tidak melengkung. Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang kelenjar dada, radang urat darah serata menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah.

 E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7 mikrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar manusia terkandung sejumlah E.colli yang berfungsi membusukkan sisa makanan.

 Pseudomonas auruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana. Medium paling sederhana untuk pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen). Metabilisme bersifat respirator tetapi dapat tumbuh tanpa O2 bila tersedia NO3 sebagai akseptor electron kadang-kadang berbau manis seperti anggur yang dihasilkan aminoasetofenon. Beberapa strain menghemolisis darah. bakteri ini pada dasarnya merugikan bagi pertanian, Bakteri ini juga memiliki karakteristik antara lain berwarna hijau kebiru-biruan serta berbentuk batang.

1.2.   MAKSUD DAN TUJUAN

MAKSUD

Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa :

1.      Mengetahui prosedur kerja pewarnaan gram

2.      Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) bakteri

3.      Mengetahi sifat bakteri berdasarkan pewarnaan gram

TUJUAN

1.      Membuat sediaan untuk pewarnaan gram

2.      Melakukan proses pewarnaan gram

3.      Mengamati morfologi dan sifat bakteri yang terdapat pada sediaan berdasarkan pewarnaan gram

BAB II

TINJAUN PUSTAKA

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.

            Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi guna pencarian dan identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sedangkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna  merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri dan perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif dan Gram negatif.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui  jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.

         Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)

         Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1)      Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

2)      Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

3)      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Ø  Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Ø  Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan     terdapat   didalam

Ø  lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

Ø  Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Ø  Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Ø  Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Ø  Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Ø   Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Ø   Peka terhadap streptomisin

Ø  Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Ø  Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Ø  Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

Ø  Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Ø  Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Ø  Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Ø  Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Ø  Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Ø   Tidak peka terhadap streptomisin

BAB III

ALAT BAHAN DAN METODE KERJA

III.1 ALAT

1)      Objek glass

2)      Pipet tetes

3)      Bunsen + korek api

4)      Ose

5)      Botol semprot

6)      Bak pewarnaan

7)      Mikroskop

III.2 BAHAN

1)      CGV (Carbol Gentian Violet)

2)      Lugol

3)      Air Fuchsin

4)      Oil emercy

5)      NaCl 0,1 %

6)      Aquades

III.3 SAMPEL

            Biakan bakteri

III.4 METODE KERJA

1)      Sediakan objek glass yang bebas dari lemak dengan jalan dilewatkan diatas api Bunsen/spiritus 2-3 kali

2)      Pijarkan ose dan ambil bakteri dari media, diletakkan diatas objek glass yan telah ditetesi NaCl, di ratakan dengan putaran satu arah (melingkar/searah jarum jam)

3)      Sediaan dikeringkan di udara

4)      Setelah kering kemudian di fiksasi dengan jalan di lewatkan di atas lampu spiritus 2-3 kali

5)      Sediaan siap untuk diwarnai

6)      Sediaan kemudian diletakkan diatas bak pewarnaan

7)      Sediaan di cat dengan CGV selama ±2 menit

8)      Bilas dengan air mengalir

9)      Zat warna diganti dengan larutan lugol selama ± 45 detik

10)  Bilas dengan air mengalir

11)  Zat warna diganti dengan alkohol 96% 

12)  Bilas dengan air mengalir

13)  Kemudian di cat lagi dengan safranin selama ± 1 menit

14)  Bilas lagi dengan air mengalir

15)  Keringkan dan lakukan pemeriksaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Sebelum melakukan pemeriksaan tambahkan oil emercy pada preparat tadi.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

IV.1 HASIL PENGAMATAN

 

            Ket. Gambar: Ditemukan bakteri gram positif basil dan coccus

IV.2 PEMBAHASAN

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

• Zat warna utama (C.Gention Violet)
• Lugol(zat Iodin)  yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama memperkuat reaksi
• Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama.
• Zat warna kedua / cat penutup (air fuksin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1.      Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.

2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugo

3.       Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fuksin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

• Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
• Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
• lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
• Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
• Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
• Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
• Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
• Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
• Peka terhadap streptomisin
• Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

• Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
• Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
• Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

• Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
• Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
• Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
• Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
• Tidak peka terhadap streptomisin
• Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 KESIMPULAN

            Berdasarkan pengamatan yang di bawah mikroskop, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel tersebut ditemukan bakteri berbentuk coccus dengan latar belakang hitam.

V.2 SARAN

Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi mahasiswa yaitu:

1.      Diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan praktikum ini berlangsung, Mahasiswa harus menggunakan  APD (Alat Pelindung Diri).

2.      Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan praktikum ini berlangsung, agar semua mahasiswa bersungguh-sungguh dalam melakukan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Suriawira,U.1985. Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, W.A. dan Margareth. F. W.1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Presscott. Lansing M. John P. Harley, Donald A klein.1993. Microbiology 2^nd Edition USA : WMC Brown Publisher.